Genomet af højere eukaryoter har en kompleks tredimensionel rumlig struktur, såsom kromatin loops (Chromatin loops), topologisk associerede domæner (TAD'er), aktive/inaktive kromatin rum (A/B rum) og kromosomale domæner (kromosom territorier) ved forskellige skalaer. Disse strukturer er vigtige for opretholdelsen af genomstabilitet, den præcise regulering af genekspression, og påvirker derved celleskæbnebestemmelse og fænotypeetablering. Den klassiske 3D-struktur af genomet afsløres hovedsageligt af forskellige high-throughput-teknologier repræsenteret ved kromosomkonformationsindfangning (3C) og dets afledte metoder såsom 4Cs, 5C, Hi-C og ChIA-PET. Disse teknologier kan fange parvise DNA-sekvenser i kernen, men formår ikke at fange synergistiske multisite-interaktioner (multi-vejs kontakt) og enkelt-molekyle topologi (enkelt-allel topologi) i cellepopulationer. Endvidere ændrer genomiske 3D-strukturer sig dynamisk under cellecyklus, udvikling og differentiering og er forbundet med kromatininteraktioner i flere gener og regulatoriske intervaller. At opnå kromosom-enkeltmolekyletopologien i en cellepopulation er vigtig for at undersøge genomets dynamiske foldemekanisme og sammenhængen med genregulerende funktioner.
Hou Chunhui, en forsker ved Kunming Institute of Zoology of Chinese Academy of Sciences, og Xiao Chuanle, en associeret forsker ved Zhongshan Ophthalmology Center ved Sun Yat-sen University, udgav en forskningsartikel med titlen High-throughput Pore-C afslører enkeltallelen topologi og celletypespecificitet af 3D-genomfoldning i Nature Communications (Nature Communications). Dette arbejde optimerer en høj-throughput Pore-C-metode, øger detektionsfluxen af højere-ordens kromatin-interaktioner betydeligt og afslører enkeltmolekylets topologiske diversitet og cellespecificiteten af det tredimensionelle genom.
Årsagen til den relativt lave sekventeringsgennemstrømning af Pore-C-teknologien kan være blokeringen af sekventeringsnanopore-kernen, fordi proteinet tværbundet til DNA'et ikke er fuldstændigt fjernet. For at løse dette problem optimerede undersøgelser enzymatiske forhold, testede strategien med multipel proteolyse og brug af blandede proteaser, øgede sekventeringsudbyttet med omkring 80 procent og næsten multiplicerede brugsomkostningerne for denne teknologi. Derudover udviklede vi MapPore-C-justeringsprocessen ved at integrere NGMLR- og Minimap2-justeringsalgoritmer, som markant forbedrede justeringens nøjagtighed og lav dataudnyttelse. I mellemtiden bekræftede vi, at HiPore-C i høj grad kan reproducere Hi-C capture-baserede kromatinsløjfer, topologi-associerede domæner og kromatinregionrum ved sammenligning med Hi-C-data. Yderligere undersøgte undersøgelsen den høje ordens interaktion mellem kromosomer, de fleste interaktioner forekommer ikke mellem telomerer og centrioler, men i genomiske regioner og danner to transkriptionel aktivitet forskellige interaktionshub, en hub gentæthed, enhancer-densitet og aktiv tilstand af kromatinrelateret epigenetisk modifikationsniveauerne er højere. Undersøgelsen fandt også, at højfrekvente interaktioner på tværs af kromosomer forekommer mellem tRNA-genberigede områder af flere kromosomer. HiPore-C højordens interaktioner forekommer ikke kun inden for TAD og rum, men spænder også over flere rum, topologisk relaterede domæner og kromatin loops. Kromatininteraktionskort baseret på direkte og indirekte DNA-fragmentinteraktioner ligner generelt konventionelle Hi-C-kort, men indirekte DNA-fragmentinteraktioner er mere tilbøjelige til at spænde over flere strukturelle enheder. Ovenstående undersøgelser afslører universaliteten af eksistensen af interaktioner på tværs af kromatindomæner og fremhæver fordelene og vigtigheden af HiPore-C-teknologi til at løse tredimensionelle højordens interaktioner på enkeltmolekyleniveau.
Vi diskuterer enkeltmolekylets topologiklynger i topologien af forskellige typer celler. Disse strukturelle klynger er grundlaget for dannelsen af sub-TAD-lignende (subTAD-lignende) domæner, med tydelig cellespecificitet, hvilket indikerer, at enkeltmolekyle topologisk diversitet er grundlaget for TAD-domænedeling i cellepopulationer, og er af stor betydning for udforske forholdet mellem rumlig organisering af genom og cellespecifik genekspression. Desuden brugte undersøgelser HiPore-C-data til at sammenligne interaktioner af højere orden i -globin-locus i erythroide GM12878-celler. Vi fandt ud af, at multi-site simultane, cellespecifikke enhancer-promotor centre dannes mellem de humane ε- og -globingenpromotorer og multiple enhancere, og at denne interaktion kan være dynamisk. HiPore-C's evne til at fange både højordens interaktion og DNA-methyleringsstatus og den positive korrelation mellem DNA-methyleringssignal og interaktionsstyrken mellem kromatin-loop-ankre, derudover kan typen af kromatin-rum skelnes nøjagtigt i henhold til DNA methyleringsniveau (A vs B). Denne undersøgelse etablerede HiPore-C-teknikken, som udførligt kan beskrive mangfoldigheden af enkeltmolekyletopologi, og afslørede, at den dynamiske foldning af enkeltmolekyletopologi er mere kompleks end tidligere antaget, hvilket yderligere forbedrede erkendelsen af loven om tredimensionel genomfoldning. .
